RACE-PCR克隆基因的建议

wajzq

0
推荐真核细胞的mRNA在加工过程中其3'末端加上一段Poly A，这是利用反转录酶制备cDNA文库的基础，但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，曾经是一个令人困扰的问题。80年代末、90年代初发展起来的一种快速获取cDNA全长的方法，即RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)，目前这个方法被广泛用于克隆各种未报道的基因，该方法基于PCR技术，步骤少，耗时短，且经济节省，只需知道mRNA内部很短的一段序列或一小段cDNA（如EST）即可用此法克隆出未知的序列。目前，RACE已经不局限在克隆cDNA上，在克隆cDNA相邻序列以及基因组片段等方面也得到越来越广泛的应用。RACE技术使传统筛库的方法寻找全长基因的过程从几个月，缩短为几天。尤其对于低丰度基因的克隆优势更为显著[1]。
我们实验室用在合成cDNA的双链后，在两端连上接头引物，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增,分别从水稻和小麦中克隆到了TPT[2,3]。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。此外，由于mRNA容易降解，很难确定得到的cDNA是全长的cDNA，还是cDNA的片断？

RNA反转录5’末端交换机制（Switching Mechanism At 5' end of the RNA Tran，SMART）技术的出现是一个新的里程碑。其原理如下：在合成cDNA的反应中，事先加入的5'末端带Oligo（dT）的SMART引物（如5'–(T)25N-1N–3'，N = A, C, G或T；N-1 = A, G或 C），由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo　dG（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3'）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG–3'），合成第二链后可以利用通用引物（UPM（Universal Primer Mix， Long：0.2mM，　5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'，Short：1mM，5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'）与NUP(Nested Universal Primer，10 mM，　5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'）进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。这个方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、利用部分已知序列克隆全长cDNA，和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等[4]。